Le cellule staminali sono cellule non specializzate in grado di dividersi dando origine contemporaneamente ad una cellula staminale (uguale alla cellula madre) ed una cellula precursore di una progenie cellulare che alla fine darà a sua volta origine a cellule terminalmente differenziate (mature). [ R. Dulbecco].
Le prime cellule staminali scoperte furono quelle emopoietiche, le quali, esprimono sulla loro superficie un particolare marker (CD34), sono in grado di ricostruire completamente e permanentemente tutte le cellule del sangue e del sistema immunitario ( es. dopo terapie antitumorali).
Le cellule staminali vengono suddivise in:
- Totipotenti: quando possono dare origine a qualsiasi tipo di cellula. Sono cellule embrionali, cioè vengono prelevate da embrioni al 5° giorno di vita.
- Pluripotenti: quando possono dare origine solo ad alcuni tipi di cellule. Possono essere Germinali embrionarie, quando vengono prelevate da embrioni di 6 settimane, cordonali o placentari, quando vengono prelevate dalla placenta e dal cordone ombelicale, adulte, quando vengono prelevate dal midollo osseo oppure dal sangue ( leucoaferesi).
Entrambi i due tipi di cellule, perché si sviluppino, necessitano dell’ azione di fattori di crescita diversi a seconda del tessuto. ( es T.N.F. della Levi Montalcini).
Anatomia e fisiologia della superficie oculare: L’epitelio corneale umano è costituito da 5-7 strati cellulari; è trasparente, avascolare e privo di cellule mucipare. Si identificano 3-4 strati di cellule squamose, più esterne, e 1-3 strati di cellule alate, intermedie ( presentano sottili estensioni laterali che si dipartono dal corpo cellulare) ed un singolo strato, più interno, di cellule basali colonnari a diretto contatto con la Bowman. Le cellule basali aderiscono alla membrana basale attraverso strutture, tra loro connesse, denominate complessi giunzionali, formati da filamenti di cheratina e collagene di tipo IV( emidesmosomi). I principali componenti del citoplasma delle cellule squamose, alate e basali, sono i filamenti intermedi noti come cheratine. Durante la differenziazione delle cellule dell’epitelio corneale, vengono espresse tre principali coppie di cheratine: K3 e K12 (presenti nell’ epitelio corneale e limbare soprabasale), e K19 ( presente nello strato basale del limbus e nella congiuntiva bulbare adiacente). Sullo strato più esterno è presente, inoltre, il glicocalice, costituito da glicoproteine, proteoglicani e i microvilli.
Il tutto poggia su un tessuto connettivo non vascolarizzato composto da tre strati: lo strato di Bowman ( zona acellulare a contatto con la membrana basale dell’epitelio), lo strato lamellare (con fasci appiattiti di collagene a disposizione perfetta al fine di garantirne la trasparenza), infine lo strato di Descemet (che rappresenta la membrana basale dell’endotelio corneale).
Importante è la presenza di un sistema di fibre nervose neurosensoriali provenienti dalla prima branca del trigemino, che arrivano al limbus con il rivestimento di mielina successivamente perdono la guaina mielinica dando origine al plesso nervoso pericorneale. L’innervazione sensoriale costituisce il braccio afferente di due archi riflessi che provocano la lacrimazione (fibre parasimpatiche del VII) e l’ammiccamento (fibre motrici del VII). Le fibre trigeminali, invece, esercitano una funzione trofica stimolando le mitosi e quindi i processi riparativi.
Il limbus: Rappresenta la porzione più esterna della cornea, comprendendo l’epitelio squamoso che connette gli epiteli corneale e congiuntivale, il tessuto connettivo e i rami delle arterie ciliari anteriori che formano delle anse nel tessuto connettivale e garantiscono nutrimento alla cornea. Le cellule basali dell’epitelio limbare sono le cellule staminali dell’epitelio corneale. Sono contenute in nicchie, costituite da pliche radiali del connettivo, ricche di vasi sanguigni e linfatici, all’interno delle quali si pone l’epitelio e le palizzate di Vogt. Tali cellule:
Sono poco differenziate, manifestando una spiccata capacità proliferativa ( clonogenicità). Se ne distinguono tre popolazioni diverse: olocloni (capaci di 120-160 divisioni, sono le cellule staminali per eccellenza), paracloni (capaci di 15 divisioni), merocloni (rappresentano una forma di riserva di paracloni).
Sono in grado di effettuare una divisione asimmetrica (una cellula figlia rimane staminale [oloclone] mentre l’altra (transient amplifying cells) intraprende il cammino di differenziazione irreversibile [ paraclone]).
Le cellule basali del limbus si differenziano da quelle della congiuntiva e della cornea perché:
Hanno un tempo di incorporazione della timidina triziata più lungo e quindi un ciclo cellulare più breve.
Non legano anticorpi anti K3, mentre legano anticorpi anti alfa-enolasi.
Sono CK5, CK14, CK19 positive, mentre sono CK3 e CK12 negative.
Esprimono il fattore di trascrizione nucleare P63.
Le cellule staminali della superficie oculare: Le superfici della congiuntiva e della cornea sono ricoperte da epiteli altamente specializzati. Entrambi gli epiteli, nella porzione basale, contengono cellule staminali immature semi quiescenti, capaci di autorigenerarsi ma anche di creare progenie che maturano e differenziano, migrando verso la superficie esterna. Queste cellule vanno incontro a processi di senescenza venendo infine rilasciate nel liquido lacrimale, immediatamente rimpiazzate da cellule che migrano dagli strati inferiori, con un turn over continuo che avviene per tutta la vita di un organismo. Appare chiaro, quindi, che l’integrità e la capacità di auto rinnovarsi, di entrambi gli epiteli, dipendano dalla presenza e funzionalità di un adeguato numero di cellule staminali. La deplezione di cellule staminali corneali causa una congiuntivalizzazione, della cornea stessa, con conseguente neovascolarizzazione e perdita della trasparenza.
Entrambi gli epiteli, corneali e congiuntivali, hanno caratteristiche in comune:
Sono entrambi di tipo squamoso e pluristratificato, in cui solo le cellule dello strato basale sono in grado di riprodursi;
Esprimono sia citocheratine (CK), polipeptidi complessi presenti sulla superficie delle cellule staminali, specifiche del tessuto epiteliale, sia marcatori per la potenzialità replicativa (Ki-67)
Nonostante ciò sono presenti anche numerose differenze:
L’epitelio congiuntivale contiene cellule staminali disperse lungo tutta la superficie epiteliale (maggiormente nel fornice), nella sua zona basale, con capacità bipotente, cioè in grado di differenziarsi sia in cheratociti (simili a quelli corneali), sia cellule globose o caliciformi (globet cells) responsabili della produzione di mucina e di sostanze vasogeniche in caso di riparazione epiteliale. Esprimono principalmente la CK 10 e la CK 19.
L’epitelio corneale contiene solo cheratociti e non globet cells. Le sue cellule staminali sono localizzate nello strato basale del limbus, che contiene solo le cellule staminali corneali (non disseminate su tutta la cornea), sono unipotenti (producono solo cheratociti) generanti cellule epiteliali che secernono la matrilisina (metallo proteinasi) in grado di inibire l’angiogenesi, fondamentale, in caso di riparazione epiteliale, al fine di mantenere la trasparenza corneale. Esprimono principalmente le CK 3 e in piccolissima parte le CK 19.
Per valutare l’entità del deficit limbare si usa la citologia ad impressione. Se la citologia rivela un epitelio K3 positivo, il limbus è funzionante; se, invece, mostra una cellularità mista K19 e K3 positive il limbus è parziamnete danneggiato; se la cellularità è K19 positiva il limbus è totalmente danneggiato.
Isolamento ed espansione delle cellule staminali: Tecnicamente e, “ idealmente”, tutti i tessuti umani possono essere rigenerati in laboratorio e poi reimpiantati sul vivente attraverso due metodiche: la terapia genica e la terapia cellulare.
La terapia genica prevede la correzione di un difetto genetico attraverso l’inserzione del gene corretto nel genoma del paziente in cui mancava o in cui era alterato. Attraverso l’utilizzo di vettori virali viene inserita la copia del gene corretto nel nucleo delle cellule staminali del tessuto malato, che sostituirà quello difettoso portando alla produzione della proteina mancante / alterata con risoluzione della patologia. Tutto ciò risulta in via di studio.
La terapia cellulare, invece, prevede l’isolamento di cellule staminali, di un determinato tessuto, la loro cultura con successiva amplificazione allo scopo di ottenere un tessuto sano da impiantare. Le tecniche a disposizione sono diverse e si differenziano, tra l’altro, per i tessuti di mantenimento, detti nicchie, su cui far crescere le cellule staminali isolate. La nicchia è importantissima perché ha il compito di fornire il microambiente ideale, ricco di sostanze e fattori di crescita, in cui sono presenti i segnali di crescita per le cellule. Appare chiaro che una nicchia non ideale fornirà segnali non ideali che porteranno alla mancata crescita di cellule staminali e conseguentemente di tessuto sano.
La tecnica più usata prevede il prelievo limbare di una porzione di tessuto di 2 x 2 mm2.
Tale tessuto viene depositato su spugne di collagene per pochi giorni, successivamente viene trasferito in terreni liquidi ricchi di sali, vitamine e fattori di crescita specifici per i cheratociti. In questa fase avviene la crescita dei precursori epiteliali indifferenziati.
Queste cellule, isolate dalla matrice liquida mediante digestione enzimatica, vengono poste in coltura con cellule feeder post mitotiche ( NIH 3T3) le quali portano alla formazione di cloni di cellule con caratteristiche fenotipiche simili alle cellule epiteliali basali (CK19 positive e CK3 negative), con alta capacità replicativa ( Ki 67 positivi).
Il clone ottenuto viene immerso in una matrice di collagene, contenete fibroblasti corneali stromali umani come cellule feeder ( HPC.33) e ciò darà origine a cellule basali non cheratinizzate capaci di differenziarsi in CK19 e CK3 positive e Ki 67 positive.
Lo strato di cellule basali ottenuto potrà essere impiantato sulla superficie del ricevente, adeguatamente preparata, tale da permettere alle cellule staminali di aderirvi, riprodursi e differenziarsi e creare così un nuovo epitelio. Appare chiaro, quindi, che il compito delle nuove cellule staminali è quello di attecchire e riprodursi, nonchè risvegliare le cellule già presenti nel tessuto ricevente. La somma di queste azioni risulta importante per il successo di un trapianto di limbus.
Si parlerà di autotrapianto, quando il prelievo del limbus avviene dall’ occhio contro laterale, mentre si parlerà di allotrapianto quando il limbus proviene da altro paziente.
La membrana amniotica e altri supporti: La membrana amniotica (MA) è lo strato più interno della porzione fetale della placenta umana. E’ costituita da un monostrato di cellule epiteliali, adese ad una spessa membrana basale e da una matrice stromale. Non contiene vasi sanguigni, è immunologicamente inerte, ha proprietà antinfiammatorie, batteriostatiche, antiangiogenetiche ed è in grado di stimolare la crescita delle cellule epiteliali. Contiene fattori di crescita, collagene, fibronectina e cistatina E, proteina con attività antivirale e antibatteriche. Quando è usata in vitro, come supporto, viene privata dell’ epitelio in quanto esso impedirebbe l’adesione e la crescita delle cellule epiteliali. In vivo, invece, può essere applicata sia con l’epitelio adeso alla superficie (patch) allo scopo di proteggere e ridurre la flogosi o gli stati dolorosi, sia con la parte basale adesa alla superficie, esplicando azione di vera e propria membrana basale:
- facilitando la migrazione di cellule epiteliali
- rinforzando l’adesione delle cellule epiteliali dello strato basale
- stimolando la differenziazione delle cellule epiteliali, prevenendo l’apoptosi epiteliale.
Altro supporto importante è la colla di fibrina. Tutti questi presidi funzionano quando è presente almeno 1 mm di limbus intatto da cui la cultura può essere sviluppata. Quando il processo chimico/infiammatorio, ha completamente distrutto tutto il limbus si dovrà ricorrere all’uso delle cellule staminali provenienti da altro donatore ( con alta terapia immunosoppressiva e scarso successo), oppure al prelievo ed isolamento di cellule staminali provenienti dalla mucosa buccale (assenza di terapia immunosoppressiva e successo dubbio ma sicuramente migliore del precedente).
